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高纯度儿茶素的制备技术

作者:刘晓辉 江和源 尧渝 出处:中国茶叶 点击:5993

儿茶素属于黄烷醇类化合物,是茶叶中最主要的生物活性成分之一,占茶叶干重的12%24%,主要包括表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)4种物质。其中,酯型儿茶素EGCGECG为主要组分,两者约占儿茶素总量的70%左右。大量研究表明,儿茶素具有清除自由基、抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗癌抗突变以及改善心血管疾病症状和调节免疫系统的作用。儿茶素作为天然活性成分,已广泛应用于食品、化妆品、医药、精细化学品、保健品等各个领域。尤其是酯型儿茶素EGCGECG在许多方面活性强于其他儿茶素组分,是当前儿茶素分离、纯化与应用研究的热点,而且EGCG单体在美国已被列为一种潜在的抗癌药物进行研究与开发。

伴随着对儿茶素组分化学结构、理化性质及药理功能研究的深入,均需要大量高纯度儿茶素作为制药原料、标准品或药物合成的前体物质,这些领域不仅要求儿茶素提取率高,而且要有高的纯度和产品质量,因此高纯度儿茶素(本文主要指纯度较高的儿茶素主要组分或其单体成分)的分离制备研究显得更为重要和突出,同时开发高效、安全、清洁的儿茶素制备方法与技术也具有重要意义。

儿茶素的提取纯化方法,主要有有机溶剂萃取法、金属离子沉淀法、超临界萃取法、膜分离法和树脂法,所得为儿茶素的粗制品。若要想得到高纯度儿茶素或其单体成分,需在分离粗产品基础上进一步纯化,目前还是以色谱分离为主。其原理是利用儿茶素各单体之间的性质差异,选择不同的吸附、洗脱剂,使之得到分离。当前应用较多的分离制备方法是柱色谱法、高效液相色谱法和高速逆流色谱法。

一、柱色谱法

柱色谱法又称柱层析法,该方法是将儿茶素粗品经一定的溶剂溶解后,上柱分离,用洗脱剂洗脱而收集儿茶素的各个组分。柱色谱的关键是柱填料与洗脱剂的选择,选用合适的洗脱剂进行等度或梯度洗脱,并定性收集无交叉的流分,从而得到纯度较高的组分。国内外报道的柱填料主要有两大类:分配层析的填料为硅胶、纤维素;凝胶层析的填料为SephadexLH-20等。

1. 分配层析法

分配层析法是利用物质成分在两相中分配系数的不同而达到分离的目的,分离的难易程度主要取决于两者的分配系数差值的大小,如果相差较大,用较小的柱和较少的填料用量即能满意的分离。19471948年,Brafield等用硅胶反复上柱分离出6个儿茶素单体,流动相为含水乙醚、含水四氯化碳和乙酸乙酯,建立了儿茶素的系统分离方法[3-4]龚正礼等将茶多酚粗品经活性碳脱色纯化,再用硅胶吸附纯化,可得到纯度为94.51%的儿茶素制品,回收率达90.1%,其中酯型儿茶素占儿茶素总量的81.27%。张肃等将茶多酚上硅胶柱后,用乙酸乙酯-甲苯进行梯度洗脱,对洗脱成分每隔2h取样一次,进行薄层色谱分离,FeCl3显色,定性收集无交叉成分的洗脱样品, 进行准确减压蒸馏,干燥,分离可得到EGCGECGEC 3种儿茶素单体,质量分数分别为98.7%99.2%98.6%,其中EGCG占茶多酚总量的51.6%

Vuataz等用纤维柱色谱法对茶多酚进行了分离,得到12个单体化合物。将茶叶乙酸乙酯粗提物1g4g用水湿润的纤维粉拌匀后上纤维柱,依次用水饱和的丙酸乙酯与石油醚(体积比9:1)、水饱和的丙酸乙酯、水饱和的乙酸乙酯、水饱和的丁醇、90%的甲醇和水进行洗脱。结果表明,ECGEGCG主要被丙酸乙酯与石油醚洗脱,(+)-GCEGC主要被乙酸乙酯洗脱,最后分别在水、甲醇和二氯甲烷、乙酸乙酯和二氯甲烷中进行结晶,得到主要儿茶素单体。

2. 凝胶柱色谱法

凝胶柱色谱也称排阻层析色谱,主要依据分子筛作用实现混合物的分离。张星海等将绿茶提取物或儿茶素粗品先经乙酸乙酯、氯仿两种试剂多次富集和脱除咖啡碱和色素,再经 SephadexLH-20柱层析纯化,得EGCG单体,用电喷雾质谱(ESI-MS)和高效液相色谱(HPLC)等方法鉴定和验证了其化学结构,单体纯度大于96.7%,得率为23.86%,回收率为71.25%。李兆基等研究表明,儿茶素粗品经过1.5m高度的葡聚糖凝胶柱,用10%30%的丙酮-乙醇二元混合溶剂洗脱,流速530mL/h,分离得到EGCGECG儿茶素单体,纯度均在90%以上,最高可达95%。戚向阳等选用Sephadex LH-20及丙酮洗脱剂分离儿茶素,但工艺时间长,托尾现象严重,产品得率低。姜绍通等采用二次柱层析方法,以葡聚糖凝胶Sephadex LH-20为柱填料,首先以无水乙醇为洗脱剂,再以40%乙醇水溶液为洗脱剂,制备得到纯度≥98%EGCGECG单体。凝胶色谱法可以成功制备高纯度的儿茶素单体,但存在工艺时间长、制备量小、生产成本高等问题,难在工业生产中应用。

二、吸附树脂法

吸附树脂法是以离子交换树脂、大孔吸附树脂和聚酰胺等作为载体,利用其对不同成分的选择性吸附和筛选作用,通过选用适宜的吸附和解吸条件借以分离、提纯某一种或某一类有机化合物的技术。树脂法提取纯化儿茶素的研究较多,张盛等选用12种大孔吸附树脂为吸附剂进行了高纯度儿茶素的研究,结果以AB-8大孔吸附树脂为柱填料,收集过柱溶液一定区段内馏分,可得到含量高达95%的儿茶素产品,其中EGCG含量大于55%。另外张盛等还探索了高ECG型儿茶素产品的工艺制备,以大叶种复合儿茶素为材料,将AB-8树脂上吸附的儿茶素经乙醇解吸,配套用溶剂萃取后续工序,可同时制备得ECG含量高达67.22%的儿茶素产品与含量为88.13%的咖啡碱产品。姜绍通等研究了7种树脂对EGCGECG的吸附和解吸性能,筛选出AB-8树脂作为吸附剂,制品中EGCG含量为80%。龚雨顺等研究了利用大孔吸附树脂柱色谱分离制备儿茶素和咖啡碱的可行性。结果表明大孔吸附树脂对儿茶素和咖啡碱的吸附和解吸性能良好,通过梯度洗脱,可对儿茶素和咖啡碱进行分离,并能制得不同规格的儿茶素产品,其中高EGCG含量(66.95%)的高纯儿茶素产品GTC-90制率达46.47%,咖啡碱低于0.5%

聚酰胺是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物,分子中含有丰富的酰胺基团,可与酚类、醌类、硝基化合物等形成氢键而被吸附,与不能形成氢键的化合物分离,在柱层析分离上有广泛的应用。王传金等采用绿茶的乙醇浸提液经浓缩、脱色和萃取,得茶多酚粗品,用聚酰胺层析柱分离提纯得(-)-EGCG单体,结果表明当所用的聚酰胺的粒度为0.1700.210mm,上样量与聚酰胺质量比为1:50时,(-)-EGCG提取率达50%。通过对醇提、脱色和分离工艺的优化,1g绿茶可提取出0.04g纯度大于 99.0%(-)-EGCG单体。唐课文用ZnCl2作沉淀剂,当溶液pH值为5.66.5,将茶叶浸提液中的儿茶素以金属盐的形式沉淀,沉淀物经洗涤后,用质量分数为40%的硫酸溶解,然后将溶液直接加入聚酰胺树脂柱上,先用蒸馏水将 Zn2+Na+等无机离子除去,再用乙醇洗脱,洗脱液经浓缩干燥后得到纯度高于99%的高纯酯型儿茶素,提取率达10.2%其中含EGCG 64%

吸附树脂法目前已广泛应用于环境保护、合成化学及生物医药等领域,具有设备与工艺过程简单,节约能源,无环境污染,树脂容易再生,可反复使用等优点。因此树脂法制备儿茶素具有良好的应用前景,可进行工业化、规模化提取纯化儿茶素。

三、高效液相色谱制备法(HPLC)

HPLC法主要用于分离纯化儿茶素的单体组分。该方法工艺为:以绿茶提取物(茶多酚)为原料,经柱色谱除去杂质,并将儿茶素中几种单体预分离为几个组分后,再用制备型HPLC分离其中含有的单体。分离效果和产品纯度提高,分离周期短。

由于茶多酚原料成分复杂,直接进色谱柱对填料的污染很大,以致降低填料的分离能力,所以对原料进行预处理除去部分杂质,使目标物富集很有必要。儿茶素预处理的柱前富集方法主要有:有机溶剂萃取、聚酰氨柱层析、Sephadex LH-20柱层析等。王霞比较了3种预处理方式,结果以有机溶剂萃取效果较好;同时比较了乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、氯仿、苯、甲苯等有机溶剂,结果表明乙酸乙酯的萃取效果最好。

戚向阳等以绿茶为原料,经乙醇浸提、浓缩、脱色和萃取,得到茶多酚粗品,上Sephadex LH-20色谱柱,用40%丙酮水溶液作为洗脱剂洗脱,使茶多酚粗品预分离为3个组分,其中一个为单一组分,经鉴定为EGCG;还有一个组分为酯型儿茶素混合物,将其用制备型HPLC分离纯化,结果该组分得到很好的分离,经鉴定分别为EGCGECG。王洪新等以茶提取物为原料,先经Sephadex LH-20柱色谱,用丙酮-水梯度洗脱,收集4个流分,其中流分Ⅲ包含:EGCGECGGCG。再用半制备型HPLC分离纯化,得到7种儿茶素单体化合物,且质量分数均在99%以上,总产率为66.7%,总收率为82.1%。钟世安以粗儿茶素粉末为原料,采用反相高效液相色谱技术,收集相应的流分,再经P-1大孔树脂,旋转蒸发浓缩洗脱液,冷冻干燥后,得到EGCGGCGECG 3种酯型儿茶素单体,纯度分别为99.2%99.4%99.5%

HPLC方法制备儿茶素分离效率高,条件易控制,单体纯度高,在保持儿茶素原药效性能的前提下,产品稳定性大大增强,且不易缩聚、不易氧化,但设备投资大、制备量小,生产成本高,难以工业化推广。

四、高速逆流色谱法(HSCCC)

高速逆流色谱法是一种较新型的液-液分配技术,于1982年由Ito首创,并在1994年将其改进后,进样量增大,能够分离克级的样品。它是一种不用任何固态支撑体或载体的液-液分配层析法,能够完全排除固体载体导致的不可逆吸附和对样品的污染、失活、变性等影响,能实现对复杂混合物中各组分的高纯度制备量分离。其特点是高速运转产生的重力使固定相能在分离柱中实现高的保留,从而大大提高了分离能力,溶剂系统中各溶剂在分液漏斗中混合后,上层为固定相,灌入色谱分离柱;下层为流动相,将茶多酚粗品溶解成5%10%的溶液。当流动相流经色谱柱时,儿茶素各组分得到分离。此方法在两相间进行,克服了使用固体吸附材料造成的样品不可逆吸附或降解的缺点。

中国农业科学院茶叶研究所在国内最早利用逆流色谱技术分离出儿茶素单体。1995年利用该技术成功地分离了6种儿茶素单体,一次性进样3g茶多酚粗提物,得到儿茶素单体粗制品2090mg,再经重结晶得到1079mg精品,其中EGCG 475mgGCG 343 mgECG 127mgEGC 152mg,纯度均大于95%。如果选取合适的茶多酚原料(EGCG含量为60%),一次性分离可得到2g左右的EGCG粗品,经结晶后可得到纯度达95%以上的EGCG。张莹等对制备型逆流色谱分离绿茶提取物中多种儿茶素单体的技术进行了研究,采用两组溶剂系统:一组是石油醚-乙酸乙酯-(0.21.02.0);另一组是正丁醇-乙酸乙酯-(0.21.02.0)系统,每次进样量为4g绿茶提取物,使用前一组溶剂系统,ECEGCGGCGECG得到了很好的分离,单体的纯度达98%,其中EGCG达到99%;使用后一组溶剂系统,表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)得到了分离,纯度达92%。曹学丽等研究高速逆流色谱分离制备高纯度单体儿茶素的工艺,优选了溶剂体系及其相应的工艺条件,制得高纯度单体儿茶素EGCGECGGCG,纯度高达98%陈理等应用高速逆流色谱法对同分异构体儿茶素的分离研究表明,以正己烷-乙酸乙酯-(体积比为1:10:10)为两相溶剂系统,上相为固定相,下相为流动相,进行二次高速逆流色谱分离,可从茶多酚中分离出克级的儿茶素同分异构体(-)-EGCG(-)-GCG,其高效液相色谱纯度均在98%以上。

高速逆流色谱法可以实现儿茶素单体的分离,但生产成本高,一次性设备投入高,制备量小,难以实现工业化、规模化生产。

五、超临界流体萃取

超临界流体萃取技术是近20年才发展起来的新型分离技术。主要是利用超临界流体的非气态也非液态的性质,使混合物中不同性质的组分得以分离。超临界流体技术在茶叶上的研究与应用主要在脱除茶叶中的咖啡碱,提取芳香物质、色素。宓晓黎等以茶叶为原料,以甲醇为改性剂在CO2的超临界压力和温度条件下进行萃取,对改性剂、超临界流体性质、静态萃取时间和动态萃取流体CO2的量对萃取率的影响分别作了研究,确定了最佳萃取条件,EGCG可以完全被萃取,儿茶素萃取率达到4%,对超临界流体萃取法应用于制备EGCG的工业化作了有益的探索。杨焱等报道采用超临界CO2提取,可使茶多酚的有效成分含量提高到90%,并尝试用该法纯化分离儿茶素,期望得到更纯的儿茶素组分,但用超临界CO2萃取存在儿茶素含量不高问题,主要原因是CO2是非极性分子,而儿茶素类都是极性分子。

目前高纯度儿茶素或单体的提纯制备,主要采用色谱法或色谱联用的方法。其中HPLC法操作简便易行、分离效果好,如果选择合适的柱操作条件,儿茶素粗品可以不经过预处理就能得到较好的分离。但该法成本较高,且分离量最小,难以大量制备儿茶素纯品。高效逆流色谱法尽管较HPLC法增大了制备量,但仍难满足大量制备儿茶素单体及工业化生产的要求。柱色谱法分离制备儿茶素尽管操作比较烦琐,但处理样品量大,尤其以大孔树脂作吸附剂,可以反复再生,重复利用,大大降低成本,将是工业化生产儿茶素的良好选择。但是,如何选用合适的柱填料,优化柱操作条件,提高柱分离的效率,仍将是一个需要继续试验与探索的问题。另外,也有人将超临界流体萃取法这种比较新兴的分离技术,用于制备儿茶素(EGCG)。该方法无污染,分离量大,利于工业化生产,但由于茶多酚在超临界CO2中溶解度较低,使得分离的得率很低。如何选取、优化萃取条件,提高EGCG的得率以及如何控制操作压力的稳定性,将是该方法在EGCG制备工业化进程中需要深入探讨的问题。

以上分离制备高纯度儿茶素及单体的方法中,树脂法因具有生产成本低、工艺简单、设备投资小、树脂再生容易、可反复使用等优点,而且有良好的应用前景有望实现高纯度儿茶素及单体的工业化、规模化生产。

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